1. The real-time PCR primer and probe set(s) which can be used to distinguish between 2009 Swine-Origin Influenza A (H1N1)from other influenza subtypes.Please also describe what are gene(s)/region(s) that you choose? And give us the reason why?
2. The conventional PCR and sequencing primer set which can be used to identify oseltamivir resistance associated NA gene mutations: N1: H274Y.
Note:a) Please show the size of PCR product and locate the position of PCR, probe, and sequencing primer used in #1 and #2b) What kind/type/name of the programs that you use for #1 and #2?
Hence:a) Algorithm used to design PCR primer, real-time PCR primer, and sequencing primer are different.
ตอบคำถามข้อ 1
จากคำถามข้อ 1 เลือกใช้ gene ของ Hemagglutinin หรือ HA เนื่องจากเป็น protein ที่แสดงออกบน envelope ของ virus โดย HA ของ Swine Influenza คือ H1
ขั้นตอนการทำ
1. หา mRNA sequence และ amino acid sequnce ของ hemagglutinin (HA) ของ swine influenza จากเว็บไซต์ http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ เลือกค้นหา Nuecleotide ของ Influenza A virus (2009(H1N1)) segment 4 hemagglutinin (HA) gene
2. หลังจากนั้นเลือก mRNA (ซึ่งมีข้อมูลของ mRNA จำนวน 39 ข้อมูล) แล้วเลือกเป็นของ Swine ปี 2009 จำนวน 2 อัน และอื่นๆ 3 อัน โดยมี GenBank accession number ดังนี้
ปี 2009
เลือก 1. GQ149662.1>> Influenza A virus (A/Mexico/4108/2009(H1N1)) segment 4 hemagglutinin (HA) gene, complete cds
2. GQ150342.1 >> Influenza A virus (A/Nonthaburi/102/2009(H1N1)) segment 4 hemagglutinin (HA) gene, complete cds
3. GQ117100.2 >> Influenza A virus (A/Ohio/07/2009(H1N1)) segment 4 hemagglutinin (HA) gene, complete cds
3. เข้าไปที่เว็บไซด์ http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html นำ FASTA ของ nucleotideใส่ลงในหน้าช่องว่าง แล้วกด run
4. จากการทำ multiple alignment พบว่ามีลำดับเบสตำแหน่งที่ 1-15 หายไปใน 1 และ 3 ส่วน 2 ที่เลือกมามีตำแหน่งเบสที่ครบดูได้จากรูป
5. เลือก nucleotide sequence ตำแหน่งที่ 651-950 สำหรับออกแบบ real-time PCR primer และ probe โดยเข้าไปที่เว็บไซต์ http://frodo.wi.mit.edu/primer3/ นำ nucleotide sequence ตำแหน่งที่ 651-950 ใส่ในช่องว่าง หลังจากนั้นเลือก pick right, left primer และ pick hybridization probe >> แล้วคลิ๊กที่ pick primers แสดงดังรูป
6. จะได้ real-time PCR primer and probe set(s) ที่ต้องการดังรูป
ตอบคำถามในข้อ 2
1. หา nucleotide sequence ของ neuraminidase จาก GenBank โดยจะได้ GenBank accession number ดังนี้ swine-originated influenza neuraminidase: GU371257.1 oseltamivir resistance: GU371269.1
2. ทำการ alignment โดยเข้าไปที่เว็บไซต์ http://www.ebi.ac.uk/Tools/emboss/align/ ใส่ amino acid sequence ลงในช่องว่างทำการ alignment พบว่า ลำดับ amino acid ตำแหน่งที่ 274 H >> Y และตำแหน่ง amino acid ที่ 828 ดังรูป
3. ทำการเลือก sequence ให้ครอบคลุม amino acid ตำแหน่งที่ 828
4. เข้าไปที่เว็บไซด์http://frodo.wi.mit.edu/primer3/ นำ sequence ที่เลือกแล้วไปใส่ลงช่องว่าง เลือก pick right,left primer >> แล้วคลิ๊กที่ pick primer
5. จะได้ conventional PCR ดังรูป
6. กลับไปที่ข้อ 4 กำหนด ค่า tm ของ primer tm min,opt และ max ใหม่เป็น 45, 50, 55 ตามลำดับจะได้sequencing primer ดังรูป
ไม่มีความคิดเห็น:
แสดงความคิดเห็น